摘 要：为了保持养殖大黄鱼肌肉质量，延长货架期，本试验采用冷藏保鲜、冰藏保鲜、 ClO₂保鲜等三种保鲜方式对鲜黄鱼进行处理。以大黄鱼肌肉的微生物变化和品质特性作为评价指标，并通过宏基因组高通量测序技术分析了经上述三种方法处理后大黄鱼肌肉优势菌属的变化。

 结果表明：冷藏保鲜和冰藏保鲜的菌落总数和TVB-N值随着贮存天数的增加而增大，而 ClO₂保鲜相对于其他处理方式变化幅度最小；三种处理组的硬度、弹性和咀嚼性均先上升后下降，而 pH 呈先下降再上升的变化，以 ClO₂保鲜组的变化幅度最小； ClO₂保鲜组在贮藏前期脂肪的氧化程度高于其他两组，贮藏5 d 后差异显著 (p<0.05)；通过电子鼻对大黄鱼肌肉风味分析表明 ClO₂ 保鲜组对其风味保持效果较好；高通量测序结果显示，三个处理组的优势菌属均为希瓦氏菌属、假单胞菌属，但菌群结构有所差别，ClO₂可以减少大黄鱼肌肉菌属的种类。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国重要的经济水产养殖鱼之一, 因其味道鲜美, 富含营养成分，而深受大众欢迎。由于新鲜大黄鱼含有较高的蛋白质和水分，极易腐败变质。目前关于大黄鱼的保鲜方法主要有辐照保鲜、超高压保鲜、气调保鲜、复合保鲜等，但因为面临技术不成熟及商业成本高等问题还不能完全普及。冰藏保鲜是常见的保鲜方法，但大黄鱼的肌肉易被腐败微生物侵染而腐败变质。二氧化氯(Chlorine Dioxide，ClO₂)作为一种新型的保鲜介质，对水体中传播的病原微生物、病毒、芽孢都有极强的杀灭作用，且具有安全无残留，效率高、副产物少、成本低等优点，是目前国际上公认的高效杀菌剂和食品保鲜剂，研究表明ClO₂对微生物的细胞壁有较好的透过和吸附性能，控制微生物蛋白质的合成，并使蛋白质中的部分氨基酸发生氧化还原反应，使氨基酸分解破坏，最终导致微生物死亡。    

目前，国内 ClO₂在果蔬保鲜方面有较多研究,但研究 ClO₂对大黄鱼肌肉保鲜处理的报道甚少。本研究选取大黄鱼肌肉作为原材料，以三种不同的保鲜方式对其进行处理，测定其微生物变化和品质特性，并利用高通量测序技术分析大黄鱼肌肉腐败菌，旨在进一步提高大黄鱼肌肉品质和延长产品保藏期，为稳定型 ClO₂冰对大黄鱼肌肉的保鲜产业化开发提供指导。

1 材料与方法  

1.1 材料与仪器

大黄鱼：选取表皮光泽无损伤，鱼鳞完整并有少量透明粘液，个体均匀，重量约为(450±50) g/条的鲜活大黄鱼。ClO₂ 试剂(A 试剂、B试剂)；基因组 DNA 抽提试剂盒；Qubit3.0 DNA 检测试剂盒 ； Taq DNA 聚合酶 ; MagicPure Size Selection DNA Beads 。A96FS70TI 型变频冰箱; TX-XT plus 质构仪 ; PEN3 型电子鼻 ; Pico-21台式离心机; 凝胶成像系统 ; Q32866 Qubit® 2.0荧光计 Invitrogen; T100TM Thermal Cyeler PCR 仪BIO-RAD。

1.2 实验方法

1.2.1 ClO₂冰的制备

参照纯欧德ClO₂试剂说明书，配制浓度为300 mg/L 的高浓度的 ClO₂溶液，将稀释至5mg/L的溶液置于制冰机中, 制备大小约(0.75±0.25)cm³的稳定型ClO₂碎冰。

1.2.2 保鲜处理

活体大黄鱼载氧运至实验室后，放在冰水中30min冷却致死后随机分成三组，冷藏保鲜(CK组)：大黄鱼装入带孔泡沫箱后并置于0~4℃环境下；冰藏保鲜(IC组)：大黄鱼装入带孔泡沫箱后加入普通碎冰覆盖，置于0~4℃环境下；ClO₂保鲜(CD组)：大黄鱼装入带孔泡沫箱后加入 ClO₂碎冰覆盖，置于 0~4℃环境下，不同组碎冰覆盖厚度均为(3.0±0.5)cm，每隔24h补充一次碎冰。选取大黄鱼背部肌肉去鳞、去皮进行指标测定, 并在第0、 1、3、5、9、13、17、21d进行样品测定分析。

1.2.3 高通量测序鉴定

1.2.3.1 样品预处理

将不同处理组的大黄鱼放入灭菌泡沫盒中0~4℃条件下保藏7d后各取肌肉200mg。将样品放入2mL 离心管中,加入70%乙醇溶液1mL, 震荡, 离心(10000r/min,3min),移去上层液体。加入1xPBS溶液,震荡混匀并再次离心(10000r/min,3 min),之后移去上层液体。将2 mL 离心管倒置于吸水纸上1m in 至无液体流出为止。离心管于55 ℃烘箱直至残留酒精完全挥发。

1.2.3.2 宏基因组DNA的提取

采用E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒提取总DNA, 并用凝胶电泳(浓度为1%琼脂糖)对所提取总DNA 的完整性进行检测，检测浓度采用超微量分光光度计(Thermo NanoDrop 2000)。将检测合格的总DNA 于-20℃条件下保存,用于后续实验。

1.2.3.3 PCR 扩增及高通量测序

经 PCR 扩增, 使用Qubit3.0 DNA 检测试剂盒进行基因组 DNA 精确定量。用于PCR 扩增的引物与 Miseq 测序平台的 V3-V4 通用引物已经融合, 341F 引物:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG; 805R 引物:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC。 经两轮PCR 扩增完成接头序列的连接。PCR 结束后，先利用琼脂糖进行电泳鉴定，之后再进行DNA 纯化回收。使用Qubit 2.0 DNA测定试剂盒精确定量回收的DNA，以便以1：1 的等量混匀后进行测序。每个样品等量混合后的DNA 量取 10 ng，最终上机时测序浓度为20 pmol。

1.2.4 菌落总数

依据GB 4789.2-2016 菌落总数的测定。

1.2.5 pH

依据GB 5009.237-2016 食品中pH的测定。

1.2.6 质构特性测定

参考廖媛媛等的操作方法略作修改，将三组大黄鱼室温下解冻20min切取背部肌肉2.5cm×2.5cm×1.5cm| 的无刺样品，用TX-XT plus质构仪进行测定。探头选用直径为5cm 的圆柱形探头。压缩探针速度为1mm/s，测试压缩比为50%，平行测定6次。

1.2.7 挥发性盐基氮(TVB-N)

按照GB 5009.228-2016方法进行试验。

1.2.8 TBARS的测定

参考马丽珍等的操作方法略作修改，称取10.0 g背部肌肉研细后，置于100 mL 的加盖锥形瓶中, 加入50mL7.5%的三氯乙酸(含0.1%EDTA), 混匀后, 室温放置30 min,浸渍液用双层滤纸过滤。滤液重复用双层滤纸过滤一次。取5mL 滤液加入25 mL 离心管中, 加入5mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液, 在90℃水浴40 min。之后流水冷却。再加入 5 mL 氯仿并摇匀。分层后取上清液分别在532 nm和600 nm处比色。记录吸光度值并用以下公式计算TBARS值。TBARS 值    与TBARS反应的物质的量(TBARS) 单位表示为mg·MA/kg。

1.2.9 电子鼻检测

参考杨茗媛等的操作方法略作修改，将不同处理组的大黄鱼肌肉解剖，取背部同一部位肌肉0.50g于10mL顶空瓶中，加盖密封，放入4℃样品盘待检，样品平衡时间20 min，平衡温度35℃, 取样体积3mL; 进样速度25mL/s, 进样口温度45℃。

1.3 数据处理

使用SAS 8.5 及 Origin 9.0进行数据分析处理,数据结果均以“mean±SD”来表示, 每组实验重复5次。同一列中的不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对大黄鱼肌肉贮藏期间细菌群落结构的影响由表 1 可以看出，CK 组中的腐败菌是希瓦氏菌属、假单胞菌属、冷杆菌属、摩根氏菌属、气单胞菌属。在IC组中，希瓦氏菌属、假单胞菌属、冷杆菌属是优势菌，而在CD 组中，仅有希瓦氏菌属和假单胞菌属是优势细菌。Ge 等研究腐败大黄鱼肌肉中分离出10株菌，其中8株产生H₂S的菌株与希瓦氏菌属密切相关，另外的两株分离株分别被鉴定为荧光假单胞菌和 Pfragi。加冰处理对摩根氏菌属、弧菌属与类香味菌属有明显的抑制效果，可能由于加冰处理抑制了嗜热微生物的生长。但ClO₂处理后大黄鱼肌肉中的菌属种类均显著降低，由于 ClO₂分子外层具有一对未成对的活泼的自由电子，具有很强的氧化能力，破坏微生物的结构，从而改变微生物菌群结构及造成数量降低。

2.2 不同处理方式对大黄鱼肌肉菌落总数的影响

图1表明，随着贮藏时间的延长，各组菌落总数均呈上升趋势。IC组前期上升趋势较CK 组不显著(p>0.05),后期上升趋势有显著差异(p<0.05)。从贮藏效果来看, CD 组>IC 组>CK 组，说明 ClO₂冰杀菌及抑制细菌增长繁殖的效果优于普通冰。ClO₂分子外层具有一对未成对的活泼的自由电子，具有很强的氧化能力，可以使微生物中含有的蛋白质(酶)中氨基酸间的链氧化断裂，使蛋白质失去活性，阻止细胞再生。季晓彤等研究也证 明了   可以起到杀菌并延长货架期的作用。

2.3 不同处理方式对大黄鱼肌肉pH的影响
图2结果所示，在贮藏过程中，每组的pH呈先下降后上升趋势。其中，CD组与前两组比较有显着性差异(p<0.05)。贮藏初期，鱼体经历僵硬、自溶两个过程中，僵硬期微生物使糖原和 ATP 分解产生乳酸、磷酸使肌肉组织酸性增强，导致 pH 下降，自溶期 pH 开始升高，由于肌肉中大量蛋白质分解为氨基酸和可溶性含氮物，这为微生物的繁殖提供了条件。pH 下降后又开始缓慢上升是由于肌肉内源性及微生物来源蛋白酶降解氨基酸产生胺类等碱性物质所致。CD组的pH下降缓慢，ClO₂具可以抑制蛋白质(酶)中的氨基酸链发生断裂，从而使蛋白质失去活性，最终使糖原和ATP 分解产酸量减少。同时，ClO₂处理后下降缓慢是由于微生物中的外源性蛋白酶失去活性，进一步抑制体系中产胺微生物的滋生，从而降低自溶程度，使pH 上升缓慢。

2.4 不同处理方式对大黄鱼肌肉质构特性的影响

图3结果表明，随着贮藏时间的延长，CD组相比较CK组和IC组的硬度(A图)、弹性(B图)、咀嚼性(C图)均呈现先上升再下降的趋势，在贮藏3天后CD组下降速度较CK组和IC 组缓慢，出现显著差异(P<0.05)。由于养殖大黄鱼在死后，进入了僵硬期，肌肉的质地特性受蛋白质、水分、脂肪含量的影响，贮藏期间，肌肉的水分含量逐渐减少，脂肪和蛋白质逐渐被氧化和分解：随后由于内源蛋白酶和腐败微生物的降解导致蛋白分子结构发生变化，继而导致硬度、弹性、咀嚼性等等指标下降。结果中 CD 组样品的质构特性优于 CK组样品，这是由于样品经过ClO₂处理后对微生物的抑制作用较强，微生物无法通过生物活性与代谢活动对大黄鱼肌肉的蛋白质产生影响；  同时，冰藏的处理方式使样品迅速降温，抑制其组织内部酶的活性及细胞的代谢，从而起到保持蛋白质特性的目的。

2.5 不同处理方式对大黄鱼肌肉TVB-N的影响

从图4 中可知，随着贮藏时间的延长，不同处理组的 TVB-N 值均呈上升趋势且差异显著(p<0.05)。在贮藏期间, IC组和CD组样品的TVB-N值上升趋势低于CK组。研究表明普通冰和ClO₂可以抑制微生物的生长繁殖并降低内源酶的作用，从而延缓蛋白质的分解，降低鱼肉的腐败程度。CD 组相比于IC 组能够较好地抑制 TVB-N值的上升，由于ClO₂通过使微生物蛋白质失活达到杀菌目的，有利于降低 TVB-N的生成速率，表明 ClO₂可以有效抑制微生物的生长。

2.6 不同处理方式对大黄鱼肌肉TBARS值的影响
TBARS 是评估脂质氧化程度的重要参考指标，TBARS值与反应中产生的醛、酮等小分子物质成正比，说明TBARS 值越大，其脂质氧化程度越高。图 5 表明不同处理组对养殖大黄鱼肌肉的 TBARS 值的影响，贮藏初期新鲜大黄鱼肌肉的 TBARS 值为 0.26mg/100g左右。贮藏前期, CD 组的TBARS 值均呈现上升趋势且较CK 组和 IC 组差异极显著(p<0.0001), 说明氧化程度严重; 其中, 贮藏初期IC组大黄鱼肌肉的 TBARS 值上升速率低于 CK 组。贮藏前期 ClO₂处理组上升较快，可能由于 ClO₂具有强氧化性，使脂肪氧化成丙二醛(MDA)，随后ClO₂进一步将醛类物质氧化为羧酸，使TBARS 含量下降。杨贤庆等研究不同浓度的 ClO₂对罗非鱼鱼丸的 TBARS 值有较好的抑制效果，且低浓度的ClO₂就能有较好的抑制效果，与本研究结果一致。

2.7 不同处理方式对大黄鱼肌肉气味变化的影响

电子鼻可以灵敏地检测到不同大黄鱼肌肉气味的变化，利用电子鼻作为完善食品在保藏期间气味变化的衡量标准，可以更准确直观的反应大黄鱼肌肉品质变化及腐败程度，避免主观因素对感官评价的影响。图6通过执行载荷分析来消除冗余传感器，根据分析，传感器S2(氮氧化物)、S6(甲烷)、S7(无机硫化物)和S9(芳香成分，有机硫化物)对大黄鱼背部肌肉具有较高的响应值，与前人研究结果相似。腐败希瓦氏菌是一种典型的冷藏海鱼腐败菌，具有较强的腐败活性，可产生H₂S，还原TMAO等物质；假单胞菌可以产生大量的醛、酮和酯类等物质。图7 表示不同处理条件下养殖大黄鱼背部肌肉电子鼻PCA分析结果，每个椭圆代表不同处理组，椭圆分布距离越远，说明气味差异性越大。图7的PC1、PC2的方差贡献率分别为92.47%、5.17%,PC1、PC2的总贡献率为97.64%。CK组、IC组、CD组分别在贮藏5d、9d、17d后的椭圆距离新鲜样品(0d) 较远, 这与菌落总数和TVB-N值一致，表明肌肉接近腐败的终点。由于PC2的方差贡献率为5.17%，说明ClO₂对于大黄鱼肌肉贡献率影响不大，说明其贡献率主要源于微生物腐败以及蛋白质自溶。

3 结论

通过高通量测序分析表明 ClO₂处理能降低菌落总数，改变菌相组成。大黄鱼肌肉经过ClO₂冰处理后，其TVB-N值、TBARS值、硬度、咀嚼性和pH等理化指标相较于冰藏保鲜变化较为小，表明ClO₂冰可以使大黄鱼肌肉保持较好的理化品质，并延长其货架期。同时，从气味变化可以看出，肌肉经ClO₂冰处理后，不仅减少其品质劣变而且又不影响大黄鱼肌肉本身的风味。