【目的】研究 ClO₂处理对厚皮甜瓜果实采后愈伤的影响为厚皮甜瓜的采后愈伤提供方法和理论依据。

【方法】以‘玛瑙’厚皮甜瓜为试材，人工模拟损伤后，用25 mg/L的ClO₂浸泡损伤果实 10min，于常温黑暗条件下进行愈伤。测定愈伤期间损伤果实的失重率以及损伤接种粉红单端孢果实的病情指数，通过甲苯胺蓝和间苯三酚—盐酸染色法观察聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素在伤口部位的积累，并用 IS Capture 图像软件对聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素积累量进行分析。测定伤口表面的色度值，分析伤口处组织愈伤期间苯丙烷代谢活性以及过氧化物酶和多酚氧化酶的活性变化。

【结果】ClO₂处理显著降低了损伤果实的失重率和损伤接种果实的病情指数，愈伤第7天时，处理比对照低10.3%。果实在损伤后不同时间段接种粉红单端孢，经1周培养观察，处理果实的病情指数显著低于对照，第7 天时处理果实的病情指数比对照低 56.9%。处理显著促进了果实伤口处聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素的积累，处理果实的积累量在愈伤的中后期显著高于对照，三者比对照分别高25.3%、77.7%和35.5%。愈伤期间，处理果实伤口处的L*值显著低于对照，b*值显著高于对照，在愈伤第5 天时，处理果实的L*值比对照低6.1%，第3天时的b*值比对照高17.8%。处理明显提高了果实伤口处的苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性，在愈伤第7天时，处理果实伤口处的苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性分别高于对照 34.3%、80.5%和 15.7%。此外，处理果实伤口处的总酚、类黄酮和木质素含量也显著高于对照，第7天时，分别高于对照14.7%、16.8%和 15.6%。

【结论】ClO₂处理可有效促进厚皮甜瓜果实的采后愈伤，ClO₂对愈伤的促进作用与激活伤口处的苯丙烷代谢，提高POD和PPO活性，促进软木脂和木质素的积累密切相关。

       【研究意义】厚皮甜瓜(Cucumis melonL.) 是我国西北地区特色水果，由于果实个体较大，在采收和采后过程中易受机械损伤，机械损伤造成的表面伤口为病原物的侵染提供了通道，加剧了采后腐烂的发生。因此，有效降低伤口性病原菌的侵染率是采后厚皮甜瓜亟待解决的问题。前人研究进展不同果实表面形成的伤口具有不同程度的愈合能力，通过在伤口部位积累软木脂和木质素等具有保护作用的天然聚合物，从而抑制伤口部位水分的大量蒸腾，阻止病原物经由伤口的侵入。近期研究发现，某些化学药物还具有促进伤口愈合的作用。例如，苯丙噻重氮可以促进采后梨果实的愈伤，脱落酸能提高采后番茄和猕猴桃果实的愈伤能力。ClO₂可杀灭病原物，对果蔬风味和品质无明显影响。有报道表明，ClO₂处理可减轻龙眼和番茄果实的采后病害，延缓苹果成熟衰老，减轻采后腐烂。还可一定程度上抑制鲜切哈密瓜的后熟。而 ClO₂在减轻采后病害中的作用与增强果实苯丙烷代谢和提高氧化酶活性密切相关。

【本研究切入点】虽然已有 ClO₂诱导采后果实抗病性的报道，但该化合物是否影响厚皮甜瓜果实采后愈伤尚未见报道。拟解决的关键问题本研究以“玛瑙”厚皮甜瓜果实为试材，用 ClO₂处理人工损伤的果实后在常温条件下进行愈伤，测定愈伤期间损伤果实的失重率以及接种果实的病情指数，观察愈伤组织的色度以及聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素的积累变化。分析氧化酶和苯丙烷代谢关键酶活性及其代谢产物的含量。评价 ClO₂处理对厚皮甜瓜果实采后愈伤能力的影响，为ClO₂处理在厚皮甜瓜的采后应用提供方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

供试‘玛瑙’甜瓜于2017年7月采自甘肃省民勤县收成乡露地大田，选取八成熟、外观整齐、大小一致、无病虫伤和机械伤的果实，单果套网套后装入瓦楞纸包装箱，于当天运抵本实验室, 在常温下 (20~25℃, RH70-80%) 贮藏待用。

粉红单端孢(Trichothecium roseum) 为甘肃厚皮甜瓜产区最常见的采后病原真菌,由本实验室提供，于PDA培养基上保存待用。

ClO₂有效浓度120mg/g，于4℃冰箱保存。

刮皮刀；恒温培养箱; 超净工作台；立式压力蒸汽灭菌锅; 正置万能显微镜;Ci6x分光光度仪； 台式高速冷冻离心机; 紫外-可见光分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 果实人工损伤及愈伤

参照姜红等的方法并进行修改。果实先用清水冲洗，然后用1%的次氯酸钠浸泡1min 进行表面消毒，再用无菌水冲洗，晾干后用刮皮刀在果实的赤道部位分别刮出4条长30mm、宽30 mm、深2mm 的伤口。在室温条件下暴露0.5 h后,将损伤的果实浸入25 mg/L的ClO₂浸泡10min,取出晾干后分别装入打孔的聚乙烯保鲜袋(25cm×40cm,厚度0.02mm),于常温、避光条件下进行愈伤，以清水处理作对照。每处理用果实120个，重复3次。

1.2.2 愈伤效果的评价

1.2.2.1 失重率及病情指数的测定

失重率的测定采用重量法。每处理用果实9个，重复3次。

病情指数的测定参照姜红等的方法并修改。在培养了1 周的T.roseum培养皿中加入一定量的无菌水，用涂布器刮下孢子用4层纱布过滤至锥形瓶中，在振荡器上振荡15 s，经过血球计数板计数配置成浓度为 1×10⁶个/mL 的孢子悬浮液。分别在果实损伤后的第0、1、3、5、7天，用涂布器将20μL配好的孢子悬浮液均匀涂于创口表面，晾干后装入打孔的聚乙烯保鲜袋中，常温培养7天后统计病情指数。每个处理用果实8个，重复3次。病情指数- ∑(高痔物口伤口个数x态减病吸别)×100式中，发病级别的标准为：4级，创口表面全部发病；3级，创口表面 3/4 的面积发病；2级，创口表面1/2面积发病；1级，创口表面 1/4 面积发病；0级，创口表面不发病。

1.2.2.2 聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素沉积的观察

聚酚软木脂(suberin poly phenolic, SPP) 和聚酯软木脂(suberin poly aliphatic,SPA)的沉积观察参照ILulai的方法并修改。用不锈钢刀片垂直伤口表面切成厚0.2~0.3 mm，长和宽各为1 cm左右的薄片。采用如下步骤进行染色：用0.1%小檗碱(0.05%甲苯胺蓝)染色45 min后, 先吸去染料, 再用蒸馏水和 75%酒精洗2~3 遍, 最后用 95%酒精洗 1~2遍，即脱去染料，紧接着在0.25%甲苯胺蓝(1%中性红)中放置1~2m in进行复染，最后用蒸馏水和 75%酒精洗去染料，SPP(SPA)即染为紫蓝色。将染好色的薄片置于载玻片上，在显微镜下荧光观察拍照。每个果实切片4处，重复3次。

木质素的沉积观察参照ALBA 等的方法并修改。用不锈钢刀片垂直伤口表面切成厚0.2~0.3mm,长和宽各为1cm左右的薄片, 滴加1%间苯三酚染色1.5min后再加1~2滴浓盐酸，木质素即染为红色，置于显微镜下观察拍照。每个果实切片4处，重复3次。

愈伤组织的SPP、SPA 和木质化细胞层的厚度根据文献的方法通过IS Capture 图像软件进行测量计算。

1.2.3 愈伤组织色度的测定

在愈伤的0、1、3、5、7 d用Ci6x 分光光度仪垂直于愈伤组织表面进行色度的测定，依次测定 L*、a*和b*值，每个处理测 12处愈伤组织。

1.2.4 生化测定取样

参照BI等的方法。在愈伤的0、1、3、5、7d，用不锈钢刀片垂直伤口表面下取2~3mm深的伤口组织3g，用锡箔纸包好后用液氮冷冻，在-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和多酚氧化酶的活性测定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)的测定参照 Liu等的方法并修改。取冷冻样品3g, 于5mL 硼酸-硼砂缓冲液(pH8.8, 含40g/L 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP), 2 mmol·L⁻¹乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 和5 mmol·L⁻¹β-巯基乙醇) 中冰浴研磨成浆, 在4℃、12 000×g条件下离心30 min, 上层酶液即为粗酶液。反应体系包括: 0.1mL 粗酶液, 3mL 硼酸-硼砂缓冲溶液液 (50mmol/L,pH8.8), 0.5mL食物L-苯丙氨酸(20mmol/L), 以蒸馏水为参比, 测定反应体系混合10s 后在290 nm波长处的吸光值作为初始值(OD₀)，将混合液在37℃水浴锅中保温1 h后在 290 nm波长处的吸光值作为终止值(OD₁)。以每小时吸光值变化值增加0.01 为一个酶活性单位 (U), 以U/g FW表示。

过氧化物酶(peroxidase,POD) 和多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO) 的测定参照Li的方法。取冷冻样品3g, 于5mL 乙酸-乙酸钠缓冲液((pH5.5, 含 1mmol/L 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),4%交联聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP) 和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)) 中研磨成浆, 在4℃、12 000×g条件下离心 30min, 收集上层液用即为粗酶液。POD反应体系: 3mL25mmol/L 愈创木酚, 0.1mL 酶提取液, 0.2mLH₂O₂(5mmol/L)。以蒸馏水为参比, 在反应进行到15s时测定混合液在470nm波长处的吸光值2min。以每分钟吸光值变化值增加1为一个酶活性单位(U)，以U/gFW 表示,重复3次。PPO反应体系:4mL 乙酸-乙酸钠缓冲液(50mmol/L,pH5.5),lmL 邻苯二酚溶液(50mmol/L), 0.1mL 酶提取液。以蒸馏水为参比, 在反应进行到15s 时测定混合液在420nm波长处的吸光值2min。以每分钟吸光值变化值增加1为一个酶活性单位 (U), 以U/mg FW表示。

1.2.6 总酚、类黄酮和木质素的含量测定

总酚和类黄酮的测定参照Pirie 等的方法并作修改。取冷冻样品3g，于预冷的4mL HCL-甲醇溶液中冰浴研磨成浆，在4℃避光条件提取20min，期间摇动数次过滤收集上层清液待用。以 1%HCL-甲醇溶液做为参比，分别测定滤液在280nm和325nm波长处的吸光度值作为总酚和类黄酮的含量，分别以OD280·g⁻¹FW 和(  表示。木质素的含量测定参照Yan等的方法进行测定。取冷冻样品3g，于预冷5mL95%乙醇中研磨成浆，在4℃, 14000×g条件下离心30min, 弃去上清液, 将沉淀物依次用95%乙醇, 乙醇(V):正己烷(V)=1：2冲洗3次，将清洗后的沉淀物在60℃烘箱中干燥24 h后转移至离心管中,溶于1mL25%溴化乙酰冰醋酸溶液,70℃恒温水浴30min后加入1mL NaOH(2mol/L)终止反应。最后加入2mL冰醋酸和0.1mL盐酸羟胺(7.5mol/L), 在4℃、12000×g条件下离心 30 min, 取上清液0.5mL并用冰醋酸定容至5mL, 在280nm波长处测定吸光值。

1.3 数据统计

上述测定均重复3次。全部数据用Excel 2010计算平均值和标准误(±SE),用SPSS 19.0进行 Duncan’s 多重差异显著性分析及相关性分析 (P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 ClO₂处理对愈伤期间果实失重率和病情指数的影响

愈伤期间，处理和对照果实的失重率均逐渐升高，但处理果实的失重率显著低于对照，第 7 天时,比对照低 10.3%(P<0.05)(图 1-A)。处理和对照果实的病情指数均随愈伤时间的延长逐渐下降，处理果实显著低于对照，第7天时，仅相当于对照的43.1%(P<0.05)

愈伤期间，处理和对照果实伤口处的SPP 和SPA积累量均逐渐增加，处理果实的积累量在愈伤的中后期均显著高于对照(图2-A，B)。SPP和SPA的积累差异分别始于第1天和第3天, 第7 天时 SPP 和 SPA 的积累厚度分别比对照高25.3%和        

处理和对照果实伤口处的木质素积累始于愈伤中期。在第7天时，处理果实木质素的积累厚度比对照高 35.5%(P<0.05)(图 3-C)。SPP、SPA 和木质素的积累结果表明, 有效促进了厚皮甜瓜果实伤口处的木栓化。

愈伤期间，处理和对照果实伤口处的L*值均先上升后下降，在愈伤的后期显著低于对照, 第5天和第7天时,分别比同期对照低6.1%和5.8%(P<0.05)(图4-A)。处理和对照果实的a*值差异不显著(结果未显示)。两者b*值总体先降后升，在愈伤的前期和中期显著高于对照。第3天时, 比对照高17.8%(P<0.05)。

处理对伤口处PAL、POD和 PPO活性以及总酚、类黄酮、木质素含量的影响

愈伤期间，处理和对照果实伤口处的 PAL 活性均逐渐升高，但处理果实的 PAL 活性显著高于对照, 第7天时, 比对照高34.3%(P<0.05)(图5-A)。对照果实的POD和PPO 活性随愈伤时间的延长逐渐升高，而处理果实的活性则先略有降低后显著升高，在愈伤的后期显著高于对照,第7天时, POD 和 PPO 活性分别比对照高80.5%和15.7%(P<0.05)(图 5-B，C)。处理果实伤口处的总酚、类黄酮和木质素含量在愈伤期间均呈先降后升的趋势,在愈伤的后期显著高于对照。第7天时,分别比对照高14.7%、16.8%和15.6%(P<0.05)(图5-D, E, F)。PAL、POD 和 PPO 活性以及总酚、类黄酮和木质素含量的增加结果表明,  激活了厚皮甜瓜果实伤口处的苯丙烷代谢以及氧化酶活性。

3 讨论

ClO₂可通过增强苯丙烷代谢和提高氧化酶活性来诱导果实的采后抗病性。本研究发现，ClO₂处理可通过激活采后厚皮甜瓜果实伤口处的苯丙烷代谢及氧化酶活性，加速软木脂和木质素在伤口处的沉积，从而促进了厚皮甜瓜果实的采后愈伤。

本研究发现，ClO₂处理可显著提高厚皮甜瓜果实伤口处的PPO活性。处理果实伤口处L*值高于对照，b*值低于对照的结果表明，PPO参与了愈伤组织的形成，处理果实伤口处的L*值在0 d 显著高于对照可能源于 ClO₂的漂白作用。在愈伤中由于细胞内膜被破坏，液泡中的酚类底物会和PPO发生反应，氧化为醌，醌再进一步聚合为黑色或褐色的物质。这些聚合物不仅引起果实组织褐变，而且可直接抑制病原菌生长，钝化病原菌分泌的胞外酶，该结果与 Wei等人在猕猴桃愈伤期间观察到的结果一致。

4 结论

ClO₂采后处理可有效降低损伤果实的失重率和损伤接种果实的病情指数，促进了厚皮甜瓜的采后愈伤。ClO₂处理对采后厚皮甜瓜愈伤的促进作用与激活果实苯丙烷代谢，提高POD和PPO活性，促进SPP、SPA和木质素在伤口处的积累密切相关。